
دانشگاه دامغان
دانشکده زیست شناسی
پایان نامه کارشناسی ارشد زیست شناسی (تمایل فیزیولوژی جانوری)
بررسی اثر محافظتی یوژنول در مقابل سمیت به دلیل هایپرآمونیا در هیپوکمپ موش صحرایی- از دیدگاه مولکولی
استاد راهنما:
دکتر تقی لشکربلوکی
استاد مشاور:
دکتر محمود اله دادی سلمانی
خرداد ماه 94
واسه رعایت تکهایی از متن پایان نامه مثلا :
(ممکنه هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزه یا بعضی نمادها و اشکال درج نشه ولی در فایل دانلودی همه چیز منظم و کامله)
چکیده
بررسی اثر محافظتی یوژنول در مقابل سمیت به دلیل هایپرآمونیا در هیپوکمپ موش صحرایی- از دیدگاه مولکولی
مقدمه: هایپرآمونیا سمیت زیادی روی سیستم عصبی مرکزی داره و موجب تشنج یا کما میشه
در این مطالعه اثر هایپرآمونیا روی بیان ناقل گلوتامات (GLT1)، فعالیت آنزیم گلوتامین سینتتاز(GS) و آنزیمهای آنتی اکسیدانتی (SOD,GPX)و هماینجور اثر محافظتی یوژنول در مقابل سمیت به دلیل هایپرآمونیا در هیپوکمپ موشهای صحرایی بررسی شد
مواد و روشها: موشهای نر بالغ با وزن 250-220 گرم به چار گروه کنترل (تزریق درون صفاقی (ip) سالین، همحجم با دارو)، آمونیا (آمونیوم استات mmol/kg 5/2،ip)، یوژنول + آمونیا و یوژنول (mg/kg 100،ip) تقسیم شدن
هر گروه شامل سه حالت بی معطلی (24 ساعت بعد از آخرین تزریق هیپوکمپ موشها خارج شد
)، استراحت (9 روز بعد از آخرین تزریق هیپوکمپ موشها خارج شد) و یادگیری (24 ساعت بعد از آخرین تزریق، تستهای رفتار انجام شد و بعد هیپوکمپ موشها خارج شد) میباشه
واسه مطالعه رفتاری از ماز آبی موریس و روتارد استفاده شد
بیان ناقل GLT1 به روش RT-PCR سنجیده شد و فعالیت آنزیم GS (سنتز glutamylhydroxamic acid-ɤ)، SOD (جلوگیری از احیا فتوشیمیایی NBT)، GPX (مصرف NADPH) و میزان MDA (روش TBRS) در هیپوکمپ مورد امتحان قرار گرفت
یافته های: یافته های حاصل از این تحقیق نشون داد که تزریق آمونیا و یوژنول باعث افزایش بیان GLT1 و کاهش فعالیت GS گردید
یادگیری موجب کاهش بیان ناقل GLT1 و افزایش فعالیت آنزیم GS شده
یادگیری تونسته اثر آمونیا و یوژنول رو خنثی کنه و تزریق یوژنول به همراه آمونیا نتونسته از اثر آمونیا کم کنه
آمونیا موجب ایجاد استرس اکسیداتیو در هیچیک از گروهها نشده
نتیجه گیری:
با اینکه یوژنول نتونسته اثرات به دلیل آمونیا رو بهبود بخشه، ولی یادگیری اثرات هایپرآمونیا رو کاهش داده
واژگان کلیدی: هایپرآمونیا، یوژنول، ناقل GLT1، آنزیم گلوتامین سینتتاز، استرس اکسیداتیو
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول مقدمه …………………………………………………………………
1
1-1 آستروسیتها……………………………………………………………………
2
1-2 نقشهای آستروسیتها در سیستم عصبی مرکزی
3
1-2-1 هومئوستاز یون، مایعات و pH
3
1-2-2 هومئوستاز گونههای اکسیژن فعال (ROS) 4
1-2-3 رابطه با سد خونی- مغزی (BBB) 5
1-2-4 انرژی و متابولیسم
6
1-2-5 تنظیم جریان خون CNS
7
1-2-6 هومئوستاز گلوتامات
8
1-3 معرفی ناقلهای آمینواسید تحریکی EAATs))
11
1-3-1 پخش ناقلهای آمینواسید تحریکی در سیستم عصبی مرکزی
12
، مدلی واسه ساختار و نقش ناقلهای آمینواسید تحریکی
12
13
1-3-4 انتقال یونها و هدایت کلر به همراه گلوتامات
14
1-3-5 نقش هدایت کلر
14
1-3-6 عملکرد پایهای انتقال در ناقلهای آمینو اسید تحریکی
15
1-3-7 ترتیب اتصال سوبسترا و یونهای همراه
16
1-3-8 بررسی جزئیات عملکرد انتقال در EAATs
16
1-3-9 دلایل پاتولوژیکی
17
1-3-10 فارماکولوژی ناقلهای گلوتامات
18
1-3-11 تحریک بیان و نقش EAAT2
19
1-4 معرفی آنزیم گلوتامین سینتتاز(GS) 19
1-4-1 آنزیم گلوتامین سینتتاز در سیستم عصبی
20
1-4-2 سطوح جور واجور تنظیم بیان آنزیم گلوتامین سینتتاز
20
1-5 حافظه و یادگیری
22
1-5-1 شکل های جور واجور حافظه
22
1-5-2 حافظه فضایی
23
1-5-3 مناطق مغزی درگیر در پردازش حافظه
23
1-6 هیپوکمپ ……………………………………………………………………23
1-6-1 مدارهای سیناپسی در هیپوکمپ و پردازش حافظه
24
1-6-2 هیپوکمپ و حافظه فضایی
24
) 25
1-8 هایپرآمونمیا
26
1-8-1 پاتوفیزیولوژی هایپرآمونمیای ابتدایی
26
1-8-2 پاتوفیزیولوژی هایپرآمونمیای ثانویه
27
1-8-3 عوامل ایجاد هایپرآمونمیای ابتدایی
28
1-8-4 عوامل ایجاد هایپرآمونمیای ثانویه
28
1-8-5 بقیه عوامل ایجاد هایپرآمونمیا 29
1-8-6 اثرات آمونیا 30
1-9 یوژنول………
……
32
1-9-1 منبع طبیعی یوژنول
32
1-9-2 خصوصیات فارماکولوژیکی یوژنول
32
1-9-2-1 خاصیت آنتی باکتریال
32
1-9-2-2 فعالیت ضد قارچی
33
1-9-2-3 فعالیت ضد التهابی
34
1-9-2-4 فعالیت ضد سرطانی
35
فصل دوم مواد و روشها
…
39
2-1 وسایل و مواد آزمایشگاهی
40
2-1-1 مواد لازم واسه RT-PCR
40
2-1-2 وسایل لازم واسه RT-PCR
40
2-1-3مواد لازم واسه امتحان آنزیمهای گلوتامین سنتتاز، گلوتاتیون پراکسیداز،سوپراکسید دیسموتاز و میزان مالون دی آلدئید
40
2-1-4 وسایل لازم واسه امتحان آنزیمها 40
2-2 شرایط نگهداری موشهای صحرایی
41
2-2-1 گروههای آزمایشی
41
2-3مطالعهی رفتاری
42
2-3-1 ماز آبی موریس (Morris Water Maze) 43
2-3-2 دستگاه روتارود
44
2-4 تهیه محلولهای لازم واسه RT-PCR
45
2-4-1 ساخت محلول D (CC10) 45
2-4-2 تهیه بافر الکتروفورز 10X TBE
45
2-4-3 تهیه ژل 5/1% آگارز
45
2-5 تهیه محلول واسه انجام امتحان آنزیم GS
46
2-5-1 محلول بافر پتاسیم فسفات 1/0 میلی مولار با 2/7pH= (حجم: CC10) 46
2-5-2 محلول STOP (حجم CC1) 46
2-5-3 محلول عکس العمل GS (حجم CC1) 46
2-5-4 محلول استاندارد
47
2-6 مطالعه مولکولی
47
2-6-1 درآورده RNA
47
2-7……
RT-PCR 48
2-7-1 سنتز cDNA (20 میکرولیتر) 48
2-7-2 PCR
49
2-7-3 الکتروفورز
50
2-8 مطالعه بیوشیمیایی
50
2-8-1 فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز(SOD) 51
2-8-2 فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز(GPX) 51
2-8-3 امتحان مالون دی آلدئید (MDA) 52
2-8-4 امتحان آنزیم GS
53
2-8-5 امتحان پروتئین به روش Brad ford
54
2-8-6 روش امتحان آمونیا پلاسما و هیپوکمپ
55
2-9 بررسی آماری…
56
فصل سوم یافته های………………
57
3-1 اثر آمونیا و یوژنول بر بیان ژن GLT1
58
3-2 اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم گلوتامین سینتتاز(GS) 63
3-3 اثر آمونیا و یوژنول بر میزان استرس اکسیداتیو
67
3-4 امتحان میزان آمونیای پلاسمای خون گروهها در حالت بی معطلی و بعد یادگیری
80
3-5 امتحان میزان آمونیای موجود در هیپوکمپ در حالت بی معطلی و بعد از یادگیری: 81
فصل چهارم بحث و نتیجهگیری………
84
4-1 بحث………… 85
4-1-1 اثر آمونیا بر بیان ناقل GLT1 و فعالیت آنزیم گلوتامین سینتتاز
86
4-1-2 اثر یوژنول بر بیان ناقل GLT1 و فعالیت آنزیم GS
87
4-1-3 اثر آمونیا و یوژنول بر استرس اکسیداتیو
90
4-2 اثر آمونیا و یوژنول بر امتحان میزان آمونیای پلاسما و هیپوکمپ
93
4-3 نتیجهگیری کلی
94
94
منابع و مراجع
95
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1‑1: (A) طرح شماتیک سد خونی- مغزی و اجزای تشکیل دهنده اون
6
شکل 1‑2: نقش آستروسیتها در جفت و جور انرژی لازم نورونهای در حال فعالیت
8
شکل 1‑3: هومئوستاز گلوتامات به کمک زایدههای آستروسیتی و ناقلهای گلوتامات آستروسیتی انجام میگیرد
10
شکل 1‑4: (A) ساختار پروتومر تک و بخشهای مارپیچ- آلفا عبور کننده از عرض غشایی
14
شکل 1‑5: عملکرد دسترسی متناوب در (B) مدل Rocker-switch (C) مدل منفذ دو دریچهدار
16
17
شکل 1‑7: چرخه اوره، و جایگاه اثر عوامل ایجاد کننده هایپرآمونمیا رو روی چرخه، نشون میبده
29
شکل 2‑1: طرز آماده سازی نمونههای استاندارد جهت امتحان آنزیم GS
53
شکل 2‑2: طرز آماده سازی نمونه هیپوکمپ جهت امتحان آنزیم GS
54
شکل 2‑3: طرز تهیه محلول استاندارد جهت امتحان پروتئین
55
شکل 3‑1: RNA تیمار یوژنول گروه یادگیری
82
شکل 3‑2: محصول PCR ژن GAPDH گروه کنترل بی معطلی
83
شکل 3‑3: محصول PCR ژن GLT1 گروه کنترل بی معطلی
83
شکل 4‑1: تنظیم سنتز گلیکوژن با فعال شدن Akt 88
شکل 4‑2: عملکرد افزایش گلیکولیز و تولید لاکتات به دلیل ورود گلوتامات
89
شکل 4‑3: شکسته شدن گلوتامات به وسیله گلوتامات دهیدروژناز و تولید انرژی واسه آستروسیت
89
شکل 4‑4: الف
نحوه کارکرد آنزیم SOD و GPX
92
شکل 4‑4: ب
حضور گلوتاتیون در محیط واسه کارکرد آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز لازمه
92
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3‑1: اثر آمونیا و یوژنول بر بیان ناقل GLT1 در حالت بی معطلی
59
نمودار 3‑2: اثر آمونیا و یوژنول بر بیان ناقل GLT1 در حالت استراحت
60
نمودار 3‑3: اثر آمونیا و یوژنول بر بیان ناقل GLT1 در حالت یادگیری
61
نمودار 3‑4: اثر آمونیا و یوژنول بر بیان ناقل GLT1 در مقایسه حالت یادگیری نسبت بهحالت بی معطلی و استراحت 62
نمودار 3‑5: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم GS در حالت بی معطلی
64
نمودار 3‑6: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم GS در حالت استراحت
65
نمودار 3‑7: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم GS در حالت یادگیری
66
نمودار 3‑8: اثر آمونیا و یوژنول بر میزان فعالیت آنزیم GS در مقایسه حالت یادگیری با حالت بی معطلی و استراحت 67
نمودار 3‑9: اثر آمونیا و یوژنول بر میزان مالون دی آلدئید در حالت بی معطلی
69
نمودار 3‑10: اثر آمونیا و یوژنول بر میزان مالون دی آلدئید در حالت استراحت
70
نمودار 3‑11: اثر آمونیا و یوژنول بر میزان مالون دی آلدئید در حالت یادگیری
71
نمودار 3‑12: اثر آمونیا و یوژنول بر میزان مالون دی آلدئید در مقایسه حالت یادگیری با حالت بی معطلی و استراحت 72
نمودار 3‑13: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در حالت بی معطلی
73
نمودار 3‑14: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در حالت استراحت
74
نمودار 3‑15: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در حالت یادگیری
75
نمودار 3‑16: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در حالت بلا فاصله
76
نمودار 3‑17: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در حالت استراحت
77
نمودار 3‑18: اثر آمونیا و یوژنول بر فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در حالت یادگیری
78
نمودار 3‑19: اثر آمونیا و یوژنول بر میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در مقایسه حالت یادگیری با حالت بی معطلی و استراحت
79
نمودار 3‑20: میزان آمونیای پلاسمای خون ٤ گروه آزمایشی در حالت بی معطلی و بعد یادگیری
80
نمودار 3‑21: امتحان میزان آمونیای موجود در هیپوکمپ در حالت بی معطلی و بعد از یادگیری
81
مقدمه
1-1 آستروسیتها
آستروسیتها از زیادترین سلولهای گلیا در سیستم عصبی مرکزی (CNS) [2] میباشن که بدون آکسون، پتانسیل عمل[3] و پتانسیل سیناپسیان
جمعیت این سلولها 10 برابر نورونها بوده و 25% تا 50% حجم مغز رو اشغال میکنن [1, 2]
از نظر ظاهری، ستارهای شکل بوده و دارای زوائد زیادی هستن که با سطح نورون اتصال غیرسیناپسی دارن [3]
این سلولها دارای زوائد دور عروقی[4]ان و حدود 85% از سطح مویرگها در مغز رو میپوشانند [2, 4]
از ویژگی آستروسیتها بیان دستهای ازفیلامنتهای حد واسطnm 9 به نام [5]GFAP میباشه که باعث تقویت ساختمون اونها میشه
GFAP مارکر شناسایی آستروسیتها میباشه [5-8]
آستروسیتها به وسیله اتصالات منفذدار[6] به هم وصل میشن و یک سنسیشیوم الکتریکی ایجاد میکنن [9]
هماینجور دارای کانالهای آبی[7] هستن که به یونها و مولکولهایی با وزن مولکولی کمتر از 1000 دالتون نفوذپذیرهستند
پس وسعتی بزرگی از مولکولها شامل نوکلئوتیدها، قندها، آمینواسیدها، پپتیدهای کوچیک،cAMP،Ca2+ ، اینوزیتول تری فسفات (IP3) از این راه عبور میکنن [10]
اینجور ارتباطات بین سلولی باعث هماهنگ شدن فعالیتهای سلولهای مجاور و فعالیتهای الکتریکی و بیوشیمیایی در خود سلول میشه
نفوذپذیری اتصالات منفذدار خیلی به وسیله اسیدیتهی خارج سلولی و یا افزایش کلسیم خارج سلولی کاهش مییابد [11]
پتانسیل استراحت غشای آستروسیتها نسبت به نورونها منفیتره
چون سلولهای گلیال شکل های جور واجور مختلفی از کانالهای پتاسیمی رو دارن، پس نسبت به نورونها به پتاسیم نفوذپذیرترند
مثلا پتانسیل استراحت غشای آستروسیتها در حدود mv 85- و پتانسیل استراحت غشای نورون در حدودmv 65- است
چون نسبت کانالهای سدیمی به پتاسیمی درآستروسیتهای بالغ بسیار کمه، آستروسیتها قادر به تولید جوابهای الکتریکی مثل پتانسیل عمل نیستن و افزایش میزان کلسیم داخل سلولی نشون دهندهی فرم تحریکی اونهاس
ولتاژ غشای آستروسیتها نسبت به تغییرات غلظت پتاسیم خارج سلولی بسیار حساس میباشه، طوری که وقتی [K+]o از mM 4 بهmM 20 میرسد، آستروسیتها در حدودmv 25 دپلاریزه میشن، در حالیکه نورونها فقط در حدود mv 5 دپلاریزه میشن
این نبود حساسیت پتانسیل استراحت نورونها به تغییرات [K+]o در محدودهی فیزیولوژیک، نمایانگر نورونها وگلیاها از راه اتصالات منفذدار با همدیگه رابطه ندارن و رابطه این سلولها با هم به وسیله فضای باریک خارج سلولی[8] (ECS) بین اونها صورت میگیرد[15]
در CNS پستانداران ECS یک جز بسیار کوچکه که به وسیله غشاهای همجوار به وجود میآید و به طور میانگین فضایی در حدود µm 02/0 میباشه [10]
ECS یک بخش بسیار فعاله، در این بخش میزان خیلی از مولکولهای آزاد شده از یک سلول مثل یونها، متابولیتهای انرژی، واسطههای عصبی و
به طور سریع به سلولهای همجوار پخش مییابند و بدین وسیله رابطه بین نورونها و سلولهای گلیا کنترل میشه [16]
تعداد صفحه :135
قیمت : 14700 تومن