اروينيا از سنجش اسپکتوفوتومتر و HPAEC-PAD ، MALDI-TOFMS استفاده شد.نتايج نشان داد فروکتان توليد شده ار لوان سوکراز نقش مهمي در بيماريزايي و تشکيل بيوفيلم دارد.در اين تحقيق براي شناسايي از PCR استفاده شد.
واسيلوا و همکاران (2012)124 در تحقيقي به منظور تاثير دما بر فعاليت فروکتوزيل ترانسفراز در باکتري لوکونوستوک مزانتروئيد سويه Lm17 از محيطي استفاده کردند که شامل 04/0 سوکروز در 27 درجه سانتيگراد براي 6-8 ساعت نگهداري شد. اندازه گيري قعاليت آنزيم در رنج دمايي 45-30 درجه سانتيگراد در حضور 010/0 رافينوز به عنوان سوبستراي ويژه براي فروکتوزيل ترانسفراز انجام گرفت. در اين تحقيق سنجش آنزيم توسط SDS-PAGE صورت گرفته است .نتايج نشان داد بهترين فعاليت آنزيم در 30 درجه سانتيگراد 29/0 و در 40 درجه سانتيگراد 72/0 است.
اهتسوکا و همکاران (1992)125 در تحقيقي به منظور بررسي خواص لوان سوکراز در باکتري راهنلا.آکواتيليس از چغندر قند نمونه گيري کرده و از محيطي شامل:گلوکز،سوکرز،عصاره مخمر استفاده کرده اند.در اين تحقيق براي سنجش آنزيم از متد yanas استفاده شده، ميزان گلوکز آزاد شده توسط کيت گلوکز اکسيداز اندازه گيري مي شود.نتايج نشان داد فعاليت مطلوب آنزيم در =6 pH و در دماي 66-55 درجه سانتيگراد بوده است و وزن مولکولي آنزيم بر روي ژل فيلتراسيون 120000 دالتون بوده که از دو زير واحد تشکيل شده است.

فصل سوم
مواد و روشها

3-1 نمونه گيري و استريل کردن نمونه ها
به منظور بررسي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز(لوان سوکراز) از منابع قندي نظير پوست پرتقال، ضايعات ليمو، ضايعات موز، سبوس گندم و خاک استفاده شد. پس از برش ميوه ها از محل هاي مورد نظر (محل هاي که رسيدگي و له شدگي دارند ) ابتدا بخش هاي جداسازي شده با آب مقطر در پليت استريل شسته شدند و دوباره بوسيله پنس استريل به پليت استريل ديگر منتقل شدند و به مدت 1 دقيقه در الکل اتيليک 070/0 قرار داده شدند و دوباره بوسيله پنس استريل به پليت استريل ديگر منتقل شدند و به مدت 5 دقيقه در هايپر کلريت سديم (آب ژاول ) 02/0 غوطه ور شدند و در مرحله بعد با پنس استريل به پليت ديگر منتقل و 5 بار با آب مقطر استريل شسته شدند تا کاملا سطحشان عاري از مواد ضد عفوني کننده شود. سپس چند هاون و دسته ي هاون برداشته درون آنها الکل ريخته و شعله ور تا بدين طريق استريل و عاري از ميکروب شوند. سپس 2 سي سي آب مقطر استريل داخل هاون ريخته و به خوبي با دسته ي هاون ضايعات و پوست ميوها کوبيده شوند تا عصاره شان بيرون بيايد و به صورت يک سوسپانسيون همگن شوند.
لازم بذکر است جهت جداسازي باکتري مولد آنزيم ميتوان به 2 روش عمل کرد:
5 گرم سوبستراهاي جامد مذکور در 10 ميلي ليتر سرم فيزيولوژي استريل سوسپانسيون شده و در 160 دور شيک مي گردند. پس از ته نشين شدن ذرات از سوپرناتانت حاصل روي محيط هاي کشت نوترينت آگار(NA)126 و محيطي MC شامل (سوکروز 50 گرم، عصاره مخمر10 گرم،منيزيم سولفات.7 آبه 5/0 گرم،آمونيوم سولفات 1 گرم،آگار-آگار 20 گرم) ( لازم بذکر است محيط MC به صورت محيط هاي روتين نيست بلکه پس از وزن کردن مواد ي به آنها اشاره شده است در 1000 سي سي آب مقطر حل نموده و در دماي 121 درجه سانتيگراد و فشار 15 پوند سترون مي شود) کشت سورفيس (يک دهم سي سي) انجام مي شود و يا پس از اينکه 5 گرم سوبستراهاي جامد مذکور در 10 ميلي ليتر سرم فيزيولوژي استريل سوسپانسيون شده و 1 ساعت در 30 درجه در 160 دور شيک شدند.ابتدا به ميزان يک ميلي ليتر سوسپانسيون به طور جداگانه به 9 ميلي ليتر محيط کشت نوترينت براث استريل افزوده پس از 24 ساعت انکوباسيون در دماي 30 درجه سانتيگراداز محيط هاي کشت کدر شده به کمک آب مقطر استريل رقت متوالي (7-10-1-10 ) تهيه گرديد سپس از همه ي رقت ها به ميزان يک دهم ميلي ليتر برداشته و به صورت سفره اي به کمک ميلي شيشه اي استريل در سطح پليت حاوي نوترينت آگار کشت داده شد.پليت ها به مدت 48 تا 72 ساعت در دماي 30 درجه انکوبه شدند.با گذشت 72-48 ساعت بر روي محيط ها که از ضايعات موز،پوست پرتقال،سبوس گندم،خاک در تماس با ميوه و خاک عمق 7 سانتيمتر کلني هاي که از نظر شکل و قوام متفاوت اند ظاهر شدند که بيشتر در پليت هاي رشد کلني ديده شد که از رقت هاي سوسپانسيون نمونه ها انجام شده بود.

( الف ) ( ب)
شکل 3-1 رشد کلني پس از 24 ساعت (الف) پرتقال (ب)خاک
سپس براي خالص سازي کلني ها دوباره بر روي هر 2 محيط کشت نوترينت آگار و ،کشت خطي يا 4 مرحله اي انجام گرديد.پس از خالص سازي کلني هاي حاصل با استفاده از روش رنگ آميزي گرم مشاهد شد.

3-2 سنجش آنزيم
پس از ظهور کلني بر روي محيط هاي کشت براي فهميدن اينکه آيا باکتري هاي جداسازي شده آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز را توليد کرده اند يا خير از سنجش آنزيم استفاده شد. براي سنجش آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز ابتدا سوسپانسيوني از باکتري تهيه شد بدين صورت که چند کلني ( با استفاده از لوپ استريل چند بار از کلني برداشته) و در سرم فيزيولوژي يا نوترينت براث استريل حل شد براي 5 دقيقه لوله هاي حاوي سوسپانسيون باکتري را کاملا شيک گرديد و در 3 ساعت يعني 6 ساعت،12 ساعت،24 ساعت در انکوباتور قرارگرفته شدند.

شکل 3-2 ايجاد کدورت در نمونه ها پس از 6 ساعت اوليه

پس از گذشت 6 ساعت اوليه در درون لوله هاي حاوي سوسپانسيون کدورت ايجاد شد که با گذشت زمان بيشتر يعني در 24 ساعت بيشترين کدورت ايجاد گرديد. سپس سانتريفوژ در 1500 دور براي 2 الي 3 دقيقه را انجام شد و بعد از آن فيلتراسيون سوسپانسيون حاوي کلني هاي باکتري ها را توسط کاغذ واتمن 41-40 يا فيلتر سر سرنگي 25 ميلي ميکروني را انجام گرفت تا فيلتره کشت حاصل شد.
سنجش فروکتوزيل ترانسفراز بر اساس متد yanas و همکاران (1922) مورد سنجش و ارزيابي قرار گرفت به اين صورت که: 5/0 ميلي از فيلتره کشت با 1 ميلي ليتر سوکروز(w/v) 020/0 و 5/0 ميلي ليتر بافراستات 1/0 مولار =5/20 pH در 37 درجه به مدت 30 دقيقه انکوبه شد.
براي تهيه بافر استات به روش زير وزن استات سديم اندازه گيري شد:
ماده گرم = مولاريته حجم حجم مولکولي
استات سديم =
يعني 3608/1 گرم ازاستات سديم در 100 سي سي آب حل شد و براي رساندن به =5/2 pH ازدستگاه pH متر استفاده گرديد.اگر pH بافر ساخته شده زياد باشد براي رساندن به =5/2 pH از اسيد کلريد استفاده مي شود و اگر کمتر از pH موردنظر بوداز پتاس استفاده ميگردد.
سپس غلظت گلوکز آزاد شده با فعاليت آنزيمي توسط کيت گلوکز اکسيداز مورد ارزيابي قرارگرفت.بدين گونه که 1000 ميکرو ليتر بلانک را به عنوان شاهد درون لوله ريخته سپس در لوله هاي حاوي نمونه 1000 ميکرو ليتر بلانک و 10 ميکروليتر فيلتره کشت (5/0 ميلي ليتر فيلتره کشت، 1 ميلي ليتر سوکروز 020/0 ،5/0 ميلي ليتر بافر استات ) ريخته سپس 20 دقيقه در دماي 25 درجه سانتيگراد و يا 10 دقيقه در بن ماري 37 درجه سانتيگراد نمونه ها را انکوبه ميشود. سپس با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر مدل UVIKON 922 جذب نوري را در 3 طول موج 490،500،510 نانومتر اندازه گيري شد.ابتدا دستگاه را با هوا کاليبره گرديد سپس دستگاه را با بلانک کاليبره شد سپس نمونه را درون کوت ريخته و جذبها خوانده شدند.اعداد نبايد بالاتر از 1 و منفي باشند. اگر اعداد بالاتر از 1 باشند بايد نمونه را با اضافه کردن 5/0 سي سي بلانک رقيق شود.جذب در 3 ساعت به شرح زير است:

جدول 3-1 جذب براي 6 ساعت

510nm

500nm

490nm

نمونه

0/581
0/580
0/560
موز 1
0/483
0/480
0/470
ليمو
0/394
0/390
0/380
موز 2
0/607
0/600
0590
خاک عميق 1
0/340
0/341
0/330
خاک عميق 2
0/660
0/658
0/649
پرتقال مثبت
0/305
0/300
0/290
پرتقال 2
0/505
0/500
0/490
پرتقال 1
0/340
0/338
0/330
پرتقال 3
0/339
0/327
0/320
پرتقال 4
0/310
0/305
0/300
سيب 1
0/317
0/315
0/310
سيب 2
0/392
0/388
0/380
سيب 3
0/700
0/698
0/690
خاک مزرعه گندم
0/499
0/492
0/482
سبوس 2
0/690
0/685
0/680
سبوس 1
0/374
0/370
0/366
خاک در تماس 2
0/701
0/697
0/690
خاک در تماس 1
0/719
0/715
0/710
خاک باغ هلو

جدول 3-2 جذب براي 12 ساعت

510nm

500nm

490nm

نمونه
0/610
0/605
0/600
موز 1
0/520
0/515
0/510
ليمو
0/433
0/430
0/424
موز 2
0/560
0/555
0/550
خاک عميق1
0/362
0/355
0/350
خاک عميق 2
0/730
0/726
0/720
پرتقال مثبت
0/310
0/305
0/300
پرتقال 2
0/610
0/605
0/600
پرتقال 1
0/355
0/350
0/346
پرتقال 3
0/350
0/345
0/340
پرتقال 4
0/358
0/355
0/350
سيب 1
0/332
0/328
0/320
سيب 2
0/483
0/480
0/472
سيب 3
0/775
0/768
0/760
خاک مزرعه گندم
0/502
0/498
0/490
سبوس 2
0/670
0/687
0/680
سبوس 1
0/455
0/450
0/445
خاک در تماس 2
0/768
0/765
0/760
خاک در تماس 1
0/802
0/798
0/790
خاک باغ هلو

جدول 3-3 جذب بعد 24 ساعت

510nm

500nm

490nm

نمونه
670/0
668/0
641/0
موز1
0/559
0/560
0/552
ليمو
0/491
0/493
0/489
موز 2
0/891
0/890
0/888
خاک عميق1
0/436
0/441
0/422
خاک عميق 2
808/0
812/0
739/0
پرتقال مثبت
0/329
0/330
0/320
پرتقال2
0/631
0/635
0/612
پرتقال 1
0/355
0/360
0/350
پرتقال 3
0/405
0/400
0/396
پرتقال 4
0/380
0/384
0/353
سيب 1
0/389
0/403
0/370
سيب 2
0/540
0/538
0/500
سيب 3
0/910
0/900
0/890
خاک مزرعه گندم
0/548
0/540
0/537
سبوس 2
0/775
0/787
0/735
سبوس 1
0/557
0/555
0/536
خاک در تماس 2
0/838
0/848
0/826
خاک در تماس 1
0/882
0/881
0/870
خاک باغ هلو

سپس طبق دستور کيت 10 ميکرو ليتر کاليبراتور و 1000 ميکروليتر معرف را درون لوله ريخته 10 دقيقه در بن ماري 37 درجه سانتيگراد يا 20 دقيقه در دماي 25 درجه سانتيگراد انکوبه شد و جذب را در 3 طول موج 510،500،490 نانومتر خوانده شد که به اين صورت است:
490 nm = 1.716
500nm = 1.734
510nm = 1.750
سپس بر اساس فرمول زير مفدار گلوکز را محاسبه شد:

Glucos =
A Sample = جذب نمونه
A Calibrator = جذب کاليبراتور
Cal.Conc = غلظت کاليبراتور
غلظت کاليبراتور را از روي تيوب مربوطه خوانده شد که 100 ميلي گرم بر دسي ليتر است.بر اساس فرمول و جذب هايي که براي نمونه و کاليبراتور خوانده شد نتايج زير بدست ثبت گرديد:

(الف)

(ب) (ج)
شکل 3-3 پايداري رنگ تست گلوکز در 6 ساعت (الف) در 12 ساعت (ب) در 24 ساعت(ج)

جدول 3-4 ميزان گلوکز بعد از 6 ساعت

510nm

500nm

490nm

نمونه
32/2 (mg/dl)
33/44 (mg/dl)
32/63 (mg/dl)
موز1
27/6 (mg/dl)
27/68 (mg/dl)
27/38 (mg/dl)
ليمو
22/51 (mg/dl)
22/49 (mg/dl)
22/14 (mg/dl)
موز 2
34/68 (mg/dl)
34/60 (mg/dl)
34/38 (mg/dl)
خاک عميق 1
19/42 (mg/dl)
19/66 (mg/dl)
19/23 (mg/dl)
خاک عميق 2
37/71 (mg/dl)
37/94 (mg/dl)
37/82 (mg/dl)
پرتقال مثبت
17/42 (mg/dl)
17/30

متن کامل در سایت sabzfile.com

دیدگاهتان را بنویسید