که زحمت بازخواني اين پايان نامه را متقبل شدند،قدرداني مي نماييم.
باشد که اين خرد ترين،بخشي از زحمات آنان را سپاس گويد.

فهرست مطالب

عنوان صفحه چکيده 1
فصل اول-کليات……………………………………………………………………………………………………………..29_2
1 مقدمه 3
1-1 پرسش اصلي تحقيق 4
1-2 فرضيه ها 4
1-3 اهداف تحقيق 4
1-4 فروکتوزيل ترانسفرازميکروبي 4
1-5 فروکتان ها 5
1-6 بيوسنتز فروکتام ميکروبي 8
1-7 ساختار فروکتوزيل ترانسفراز 11
1-8 سازماندهي ژني فروکتوزيل ترانسفراز ها 16
1-9 بيان ژني فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي 20
1-10نقش بيولوژيکي فروکتوزيل ترانسفراز و فروکتان ها 24
1-11 پيشرفتهاي اخير در تحقيقات بر روي فروکتان ها 27
فصل دوم : مروري بر تحقيقات انجام شده در ايران و خارج از ايران……………………………………..34 _29
1-1 تحقيقات انجام شده در ايران 30
1-2 تحقيقات انجام شده در خارج از ايران 30
فصل سوم: مواد و روشها………………………………………………………………………………………………..51_35
3-1 نمونه گيري و استريل کردن نمونه ها 26
3-2 سنجش آنزيم 37
3-3 بررسي مولکولي 47
3-3-1 استخراج DNA از ايزوله 47
3-3-2 آناليز کيفي و کمي DNA استخراجي 48
3-3-3 طريقه ساخت بافر 48
3-3-4 الکتروفورز 48
3-3-5 آناليز کمي 49
3-3-6 واکنش PCR 49
3-3-6-1اجزاي واکنش srDNA-PCR16 49
3-3-7 آناليز کيفي محصولات PCR………. 50
فصل چهارم : نتايج ……………………………………………………………………………………………………. …69 _51
4-1 جداسازي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز 52
4-2 شناسايي فنوتيپي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز 52
4-3 نتايج استخراج DNA ژنومي 58
4-4 نتايج واکنش srDAN-PCR16 59
4-5 رديف سازي توالي بدست آمده در بانک ژن 59
4-6 رديف سازي توالي بدست آمده در بانک ژن به منظور تعيين گونه باکتري 59
فصل پنجم-بحث و نتيجه گيري………………………………………………………………………………………74_69
5-1 نتيجه گيري 73
5-2 جمع بندي 73
5-3 پيشنهادات 74
منابع 75

فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1 بررسي ويژگي هاي جنبشي آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز 10
جدول 3-1 جذب پس از 6 ساعت 40
جدول 3-2 جذب پس از 12 ساعت 41
جدول 3-3 جذب پس از 24 ساعت 42
جدول 3-4 ميزان گلوکز پس از 6 ساعت 44
جدول 3-5 ميزان گلوکز پس از 12 ساعت 45
جدول 3-6 ميزان گلوکز پس از 24 ساعت 46
جدول 3-7 اجزاي واکنش . srDNA-PCR16 49
جدول 3-8 پرايمر ها و اندازه قطعه تکثيري 50
جدول 3-9 برنامه هاي دمايي ترموسايکر 50
جدول 4-1 شکل ميکروسکوپي نمونه ها 53
جدول 4-2 نتايج تست هاس افتراقي 54
جدول 4-3 باکتري هاي موجود در نمونه ها 56
جدول 4-4 نتايج در سطح جنس و گونه 68

فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1 طبقه بندي انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجيره ?-D فروکتوزيل با سوکروز 7
شکل 1-2 توزيع آنزيم فروکتوزيل ترانسفرازدر 7 گروه از نظر فيلوژنتيک 16
شکل 1-3 ساختار ژنهاي آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز در باکتريها مولد 20
شکل 1-4 تنظيم بيان ژن فروکتوزيل ترانسفراز در برخي باکتري هاي مولد 23
شکل 3-1 رشد کلني پس از 24 ساعت 37
شکل 3-2 ايجاد کدورت پس از 6 ساعت اوليه 38
شکل 3-3 پايداري رنگ تست گلوگز در 6،12،24 ساعت اوليه 43
شکل 3-4 دستگاه الکتروفورز 49
شکل 3-5 دستگاه ترموسايکلر 50
شکل 4-1 شکل ميکروسکوپي کلني پس از رنگ آميزي 52
شکل 4-2 نتيجه استخراج DNA ژنومي 58
شکل 4-3 محصول تکثير PCR 59
شکل 4-4 پرايمر ريورس نمونه خاک عميق 60
شکل 4-5 پرايمر ريورس نمونه پرتقال 61
شکل 4-6 پرايمر ريورس نمونه پرتفال 62
شکل 4-7 پرايمر ريورس نمونه سبوس 63
شکل 4-8 رديف همترازي سازي نمونه خاک عميق 64
شکل 4-9 رديف همترازي سازي نمونه پرتقال 65
شکل 4-10 رديف همترازي سازي نمونه پرتقال مثبت 66
شکل 4-11 رديف همترازي سازي نمونه سبوس 67

فهرست نمودار ها

عنوان صفحه
نمودار 4-1 ميزان توليد گلوکز در 6 ساعت 57
نمودار 4-2 ميزان توليد گلوکز در 12 ساعت 57
نمودار 4-3 ميزان توليد گلوکز در 24 ساعت 58

چکيده فارسي
فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي، پلي مرهايي هستند که در بيوسنتز فروکتان ميکروبي (لوان، اينولين، و اوليگوساکاريد-قندميوه اي) ، نقش دارند واز نظر ساختاري، فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي، دامنه ي کاتاليزوري خانواده ي گليکوزيد هيدروليز 68 را به اشتراک مي گذارند و در هفت گروه که از نظر فيلوژنتيک به هم مربوط مي شوند، گروه بندي مي گردند. فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي از باکتريهاي گرم مثبت- گرم منفي و قارچ ها جدا شده اند. فروکتوزيل ترانسفراز داراي وزن مولکولي 480 کيلو دالتون مي باشد. بروز ژن فروکتوزيل ترانسفراز ، عمدتا توسط سيستم هاي دوجزئي يا مکانيزم هاي فسفريلاسيون تنظيم مي شوند که به دسترسي سوکرز يا ساير سيگنال هاي محيطي پاسخ مي دهند. فروکتان هاي ميکروبي، در ايجاد مقاومت در مقابل فشار محيطي مانند بي آبي، جذب مواد غذايي، تشکيل بيوفيلم و عوامل ويرولانس، نقش دارند.فروکتوزيل ترانسفراز سبب تسريع انتقال واحد فروکتوزيل به تعدادي از پذيرنده هاي مختلف مانند آب در واکنش هيدروليز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز يا فروکتان در پلي مريزاسيون استفاده مي کند .هدف از انجام اين تحقيق جداسازي و شناسايي مولکولي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز از نمونه هاي محيطي بوده است. به اين منظور براي بررسي باکتري هاي مولد آنزيم فوکوزيل ترانسفراز(لوان سوکراز) از منابع محيطي نظير پوست پرتقال، ضايعات ليمو، ضايعات موز، سبوس گندم و خاک استفاده شد. پس از تهيه سوسپانسيون و ته نشيني ذرات سوپرناتانت حاصل روي محيط هاي کشت NA و MC کشت داده شد. پليت ها به مدت 48 تا 72 ساعت در دماي 30 درجه انکوبه و سپس کلني هاي حاصل با روش هاي متداول و استاندارد باکتري شناسي شناسايي و تعيين هويت گرديدند.سنجش آنزيم فوکوزيل ترانسفراز(لوان سوکراز) براساس متد Yanase و همکاران(1992) مورد سنجش و ارزيابي قرار گرفته و غلظت گلوکز آزاد شده با فعاليت آنزيمي توسط کيت گلوکز ارزيابي شد. پس از شناسايي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز با روش بيوشيميايي سويه هايي که بيشترين فعاليت آنزيمي را داشتند با روش PCR شناسا يي و ايزوله هاي برتر با روش 16srDNA نيز ارزيا بي و تعيين هويت گرديدند. نتايج نشان داد بهترين و بيشترين ميزان توليد آنزيم در 24 ساعت ،طول موج 500 نانومتر و 37 درجه سانتيگراد به ميزان آنزيم توسط باکتري هاي باسيلوس. تورنجنسيس 45/38mg/dl،آرتروباکتر. نيکوتينا36/62mg/dl، باسيلوس . سرئوس46/08mg/dl بوده است. بنابراين مطالعه حاضر نشان داد که نمونه هاي محيطي حاوي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز مي باشد.

کليد واژه: آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز، باکتري هاي مولد، منابع محيطي، جداسازي و شناسايي مولکولي

فصل اول

مقدمه و کليات تحقيق

1. مقدمه
لوان يا پلي فروکتوز اگزوپلي ساکاريد متشکل از واحد هاي فروکتوزي است(ارناندز و همکاران،2005) 1 که داراي وزن مولکولي 107 دالتون و حدودا از 60000 واحد فروکتوز تشکيل شده است که در اثر آنزيم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتري توليد ميشود(آلرگر و همکاران،2006)2. گياهان گلدار لوان را در واکوئل هاي خود به عنوان منبع قندي براي سازگاري با شرايط سرما و خشکي ذخيره مي شود اما در باکتري ها نقش تامين کننده منبع انرژي را ايفا مي کند.(با نگئولا و همکاران،2006)3 برخي باکتريها از قند سوکروز به عنوان منبع کربن استفاده ميکنند و در نتيجه قادر به توليد آنزيم فروکتوزيل ترانسفرازهستند(شاشيکالا و همکاران،2001)4.آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز داراي 2 سوبسترا 2،6 بتا – دي فروکتوزيل و سوکروز است که طي واکنش گليکوزيل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 2،6 بتا – دي فروکتوزيل را توليد مي کند(شاشيکالا و همکاران،2001).
آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز يک آنزيم خارج سلولي با وزن مولکولي 480 دالتون که سبب تسريع انتقال واحد فروکتوزيل به تعدادي از پذيرنده ها از جمله ساکاروز ،آب و پليمر فروکتان مي شود(شاشيکالاوهمکاران،2001؛با نگئولا و همکاران، 2006؛ارناندز و همکاران،2005). فعاليت اين آنزيم در گستر ه هاي از فرآيند ها شامل بقاي باکتري در خاک (باسيلوس سوبتليس) فتو پاتوژنسيس (اروينيا و سودوموناس) همزيستي (باسيلوس پلي ميکسا) و متابوليسم فروکتان در گياهان است(هرناندز و همکاران،1995) 5. اين آنزيم در باکتريهايي همچون ژئو باسيلوس استرئوترموفيلوس ،باسيلوس سرئوس،لاکتو باسيلوس رئوتري،لوکونوستوک مزانتروئيد،استرپتوکوکوس ساليويروس، باسيلوس پلي ميکسا ومخمرهاي همچون آسپرژيلوس و رودوترولا و قارچ توليد مي شود(بنتينگ و همکاران،2001)6. اين آنزيم در صنايع مواد غذايي و داروسازي و همچنين در تشخيص بيماري ديابت و پاتوژنز بيماري پريودنتال استفاده مي شود (پابست و همکاران، 1997؛ آلگر وهمکاران، 2004) 7.
در اين تحقيق استفاده از نمونه هاي محيطي نه تنها سبب استخراج آنزيم مورد نظر بلکه هم در وقت و هم در هزينه صرفه جويي مي شود و راندمان توليد به مراتب بيشتر خواهد شد.

1-1 پرسش اصلي تحقيق
1. آيا امکان جداسازي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز از نمونه هاي محيطي وجود دارد؟
2. آيا باکتريهاي استخراج شده آنزيم مورد نظر را دارند؟
3. آيا پتانسيل مناسبي جهت توليد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز در باکتريهاي محيطي وجود دارد يا خير؟

1-2 فرضيه ها
1.پتانسيل توليد آنزيم ترانسفراز در باکتريهاي محيطي در حضور بقاياي گياهي وجود دارد.
2.ميزان توليد آنزيم بسته به ميزان سوبسترا و دماي محيط متفاوت است

1-3 اهداف تحقيق
1.جداسازي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسقراز ازنمونه هاي محيطي
2.شناسايي مولکولي و تعيين سکانس ايزوله هاي موثر در توليد آنزيم
3.هدف کاربردي : ايجاد دانش فني توليد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز

1-4 فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي
فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي، پلي مرهايي هستند که در بيوسنتز فروکتان ميکروبي (لوان، اينولين، و اوليگوساکاريد-قندميوه اي) ، نقش دارند) هرناندز و همکاران،2008) 8. از نظر ساختاري، فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي، دامنه ي کاتاليزوري خانواده ي گليکوزيد هيدروليز 68 را به اشتراک مي گذارند و در هفت گروه که از نظر فيلوژنتيک به هم مربوط مي شوند، گروه بندي مي گردند(هرناندز و همکاران،2008). ژن هاي کدگذاري شده ي فروکتوزيل ترانسفراز در اپرون ها يا گروه هاي مرتبط با ساير ژن هايي سازمان دهي مي شوند که به ترشح متابوليسم کربوهيدرات يا

متن کامل در سایت sabzfile.com

دیدگاهتان را بنویسید